故事背景設於1938年印第安納瓊斯與父親依據筆記上的記載，尋找傳說耶穌於最後晚餐所用的聖杯。由於傳說中的聖杯有治癒任何傷口的神奇功效，引起了德國納綷的覬覦，特別派出了美豔女間諜艾兒莎史奈德博士，利用美色與苦肉計迫使瓊斯交出筆記。ꀀ瓊斯父子發現艾兒莎的企圖後，費盡心思將筆記奪回，前往聖殿取聖杯，不料納綷尾隨在後，並槍傷瓊斯的父親，一番苦戰之後才逃離納綷的糾纏。原以為無事的瓊斯急忙以聖杯舀水治癒父親，卻沒想到艾兒莎出現面前要搶奪聖杯……